绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

　　【摘要】  　　目的： 表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法： 用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析，获得复性的His-EGFP-CRP蛋白；并用高效毛细管电泳（HPCE）技术对复性的蛋白进行检测，了解蛋白质的等电点及活性。结果： 转化实验发现，该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21（DE3）中能够被诱导表达；通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白；HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个，其在电泳液pH值低于6时易检出，His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论： 成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP，通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白，复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6，以单体或多聚体等结构形式存在，具有结合活性，能与细胞内相关分子结合成复合物，可应用于CRP功能和内化机制的研究。
　　【关键词】  C反应蛋白； 基因表达； 蛋白质复性； 电泳，毛细管
　　［Abstract］ Objective: To express the purified recombinant protein, His-EGFP-CRP, and to evaluate the feasibility of its application in the research of function and internalization mechanism of human C-reactive protein （CRP）。 Methods: The re-constructed vector pET14b/EGFP-hCRP was transformed into Escherichia.coli BL21（DE3）， induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）。 The expressed protein, His-EGFP-CRP, was purified with affinity chromatography method and refolded with gradient filtration. The renatured His-EGFP-CRP was analyzed with high performance capillary electrophoresis （HPCE） to evaluate its isoelectric point （pI） and bio-activity. Results: Fusion protein His-EGFP-CRP successfully expressed in transformed E. coli cells after the induction, and then was purified with inclusion lysis and affinity chromatography. His-EGFP-CRP was detected at several peaks of the fraction profile of HPCE when the pH of electrophoresis buffer was under 6. The number of His-EGFP-CRP detection peaks increased after the protein was incubated with lysate of THP-1 cells. Conclusions: The pI of His-EGFP-CRP is about 6, and its structures may be monomer or polymer, which have the ability to bind relative molecles in lysate of THP-1 to form complex. These results suggest the recombinant protein could be used in exploiting the function and internalization mechanism of human CRP.
　　［Key words］ C-reactive protein; gene expression; protein renaturation; electrophoresis,capillary
　　C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种发现较早的蛋白质，在急性心肌梗塞、创伤、感染、炎症、外科手术和肿瘤侵润时，其血浆浓度急剧升高，达到正常水平的数百倍，乃至数千倍，可以作为上述疾病的临床监测指标，是急性期蛋白的主要成员之一［1］。CRP在免疫反应过程中能识别病原体和宿主受损细胞，介导补体系统和吞噬细胞将它们清除，发挥免疫调理功能［2］。除此之外，近些年来研究表明CRP的功能十分复杂，发现其能通过胞膜进入培养的主动脉内皮细胞，从而参与粥样动脉硬化症等心血管疾病的发生［3～5］。然而，对于CRP内化进入细胞的行为和机制还缺乏深入的研究，原因之一是纯化原核表达的CRP有较大难度，不易获得有体外活性的重组表达物。为解决这一技术难题，构建了带his纯化标签和EGFP荧光标记的人CRP原核表达质粒［4］。在此工作基础上，对该融合蛋白的表达纯化和复性进行了探索，并利用高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。
　　1  材料和方法
　　1.1  材料
　　台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直电泳系统（GE Healthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5α（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）由Calbiochem公司生产；microcon YM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALON Metal Affinity Resin（BD Bioscience Clontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）由Hyclone公司生产；protease inhibitor cocktail（sigma公司）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达
　　用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5 ml LB培养液（Amp+）中，37 ℃振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5 μl 100 mmol/L IPTG到5 ml的菌液中，室温振荡4 h，取1 ml菌液3 000 r/min离心5 min，加入200 μl 1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1 ml加入到200 ml LB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。
　　1.2.2  His-EGFP蛋白的纯化
　　按TALON Metal Affinity Resin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用4 ml 冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清加入到装有TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，按操作说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。
　　1.2.3  His-EGFP-CRP蛋白的纯化
　　配制缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5％甘油、0.5 mmol/L DTT，pH 7.9）。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 ℃ 8 000 r/min离心菌液10 min，用10 ml含 5％TritonX-100缓冲液A重悬沉淀，超声波裂解细菌，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入5 ml的玻璃匀浆器内，加入10 ml含5％TritonX-100的缓冲液A充分匀浆沉淀，室温静置20 min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤1次。加入10 ml含3％十二烷基肌氨酸钠（SKL）和0.3％十二烷基硫酸钠（SDS）的buffer A，充分重悬沉淀，静置60 min以缓慢溶解包涵体。溶解产物4℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清加入到microcon YM-10中，超滤浓缩到原体积的1/2。然后加入到TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。
　　1.2.4  SDS-PAGE检测质粒原核表达和蛋白纯化情况
　　分别取少量未转化质粒的BL21（DE3）、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。

作者：不详　来源：网络

我站的写稿流程为：客户咨询——提交有关材料和要求——银行办理汇款——安排写稿——初审——终审——交稿——客户反馈。